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Quantitative und qualitative Analyse der Transkription CcpA-regulierter Gene Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Un

Zusammenfassung 1 1 Zusammenfassung Der zentrale Regulator der Kohlenstoffkatabolitenregulation (KKR), das Katabolitkontrollprotein A (

Diskussion 91 und anaeroben Umweltbedingungen ist (Reents et al., 2006; Schilling et al., 2007; Speck & Freese, 1973). 5.5 Ausblick Die z

Literaturverzeichnis 92 6 Literaturverzeichnis Alcaraz, L. D., Moreno-Hagelsieb, G., Eguiarte, L. E., Souza, V., Herrera-Estrella, L. &

Literaturverzeichnis 93 Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. H., Lin-Chao, S. & Cohen, S. N. (2002). Global analysis of mRNA decay an

Literaturverzeichnis 94 Bustin, S. A. & Nolan, T. (2004). Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reacti

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Literaturverzeichnis 96 Galluzzi, L., Penna, A., Bertozzini, E., Vila, M., Garces, E. & Magnani, M. (2004). Development of a real-time

Literaturverzeichnis 97 Holtzclaw, W. D. & Chapman, L. F. (1975). Degradative acetolactate synthase of Bacillus subtilis: purificat

Literaturverzeichnis 98 Jürgen, B., Barken, K. B., Tobisch, S., Pioch, D., Wumpelmann, M., Hecker, M. & Schweder, T. (2005). Appli

Literaturverzeichnis 99 Lavergne, J. P., Jault, J. M. & Galinier, A. (2002). Insights into the functioning of Bacillus subtilis

Literaturverzeichnis 100 Marco, M. L. & Kleerebezem, M. (2008). Assessment of real-time RT-PCR for quantification of Lactobacillus plant

Einleitung 2 2 Einleitung 2.1 Der Modellorganismus Bacillus subtilis Bacillus subtilis ist ein Vertreter der apathogenen Gram-positiven Bakter

Literaturverzeichnis 101 Nessler, S., Fieulaine, S., Poncet, S., Galinier, A., Deutscher, J. & Janin, J. (2003). HPr kinase/phosphorylase

Literaturverzeichnis 102 Postma, P. W., Lengeler, J. W. & Jacobson, G. R. (1993). Phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransfer

Literaturverzeichnis 103 Renna, M. C., Najimudin, N., Winik, L. R. & Zahler, S. A. (1993). Regulation of the Bacillus subtil

Literaturverzeichnis 104 Schlottmann, I. (2009). Analyse der CcpA-Punktmutanten R54E und R54F in Minimalmedium. Naturwissenschaftliche Fakult

Literaturverzeichnis 105 Shivers, R. P., Dineen, S. S. & Sonenshein, A. L. (2006). Positive regulation of Bacillus subtilis a

Literaturverzeichnis 106 Stein, T. (2005). Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions. Mol Microbiol 56

Literaturverzeichnis 107 Tojo, S., Satomura, T., Morisaki, K., Deutscher, J., Hirooka, K. & Fujita, Y. (2005). Elaborate transcription r

Literaturverzeichnis 108 Wang, E., Bauer, M. C., Rogstam, A., Linse, S., Logan, D. T. & von Wachenfeldt, C. (2008). Structure

Literaturverzeichnis 109 Zeigler, D. R., Pragai, Z., Rodriguez, S., Chevreux, B., Muffler, A., Albert, T., Bai, R., Wyss, M. & Perkins, J.

Abkürzungsverzeichnis 110 7 Abkürzungsverzeichnis % (v/v) Volumenprozent % (w/v) Massenprozent AXXX Absorption von bei einer Wellenläng

Einleitung 3 2.2 Das Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferasesystem Die Aufnahme vieler bevorzugter Kohlenstoffquellen wie Glukose, Fruktose, Man

Abkürzungsverzeichnis 111 KbE Koloniebildende Einheit Km Kanamycin lacZ Gen der -Galaktosidase LB Luria-Bertani (Medium) mRNA

Abkürzungsverzeichnis 112 Einheiten ° C Grad Celsius g Gramm h Stunde J Joule l Liter m Meter M Molar min Minute s Sekunde U

Versicherung an Eides statt Versicherung an Eides statt Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich diese Arbeit selbstständig verfasst und

Erklärung über frühere Promotionsversuche Erklärung über frühere Promotionsversuche Hiermit erkläre ich, dass das vorliegende Schriftstüc

Einleitung 4 2.3 Kohlenstoffkatabolitenregulation in Bacillus subtilis Die Kohlenstoffkatabolitenregulation (KKR) steuert die Verwertung

Einleitung 5 et al., 2006; Seidel et al., 2005) (Abb. 2.2). Im Folgenden werden die zentralen Komponenten der KKR in B. subtilis näh

Einleitung 6 2.3.1 Die zentralen Komponenten der KKR: CcpA – HPr und Crh – Glukose-6-P und FBP Die Auflösung der Kristallstrukturen d

Einleitung 7 lokalisiert sind oder diesen überlappen (z.B. amyE (Kim et al., 2005)). Die stromabwärts gelegenen cre- 

Einleitung 8 Übersäuerung zu verhindern, wird der Überflussmetabolismus aktiviert, welcher Pyruvat hauptsächlich in Acetat umwandelt

Einleitung 9 2.3.4 CcpA-vermittelte Repression am Beispiel von xynP und xylA Die Verwertung der sekundären Kohlenstoffquelle Xylan bzw

Einleitung 10 Abb. 2.4: Verwertung von Xylan in B. subtilis (nach Singh et al., 2008). Xylan wird durch extrazelluläre Xylanasen in Xylano

Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündl

Einleitung 11 dynamischen Interaktionen in und zwischen Zellen, Organen und Organismen und die Vorhersage der Lebensvorgänge (Kitano, 200

Einleitung 12 schnell die Zelle als Reaktion auf die Änderung der Glukoseverfügbarkeit die Transkription der Zielgene beeinflusst. Dazu ist

Einleitung 13 2.5 Quantifizierung von mRNA mittels quantitativer real-time PCR Die Verwendung der real-time PCR für die quantitative An

Einleitung 14 Die hohe Sensitivität der Methodik hat zur Folge, dass viele Faktoren die Zuverlässigkeit der Analyse entscheidend beeinflussen, w

Einleitung 15 Abb. 2.6: Schematische Darstellung der RT-qPCR. Die in die Reaktion eingesetzte Gesamt-RNA enthält bis 5 % mRNA. Die mRN

Einleitung 16 2.6 Zielsetzung der Arbeit Die KKR in B. subtilis ist qualitativ bereits gut erforscht. Bisherige Studien untersuchten

Material und Methoden 17 3 Material und Methoden 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien Tab. 3.1: Chemikalien Chemikalie Bezugsquelle Adenosintrip

Material und Methoden 18 Glukonat Sigma, München, Deutschland Glukose (Glk) Roth, Karlsruhe, Deutschland L-Glutaminsäure Roth, Karlsruhe, Deutsc

Material und Methoden 19 Natriummolybdat Merck, Darmstadt, Deutschland Natriumsuccinat Merck, Darmstadt, Deutschland Nukleotidtriphosphate PeqLa

Material und Methoden 20 3.1.2 Geräte Tab. 3.2: Geräte Gerät Bezugsquelle Autoklav Systec 5075 EL Systec GmbH, Wettenberg, Deutschland Biofuge

Meiner Familie Mein Fels in der Brandung Professor Dr. Wolfgang Hillen Dessen Charakter und Persönlichkeit mir ein Vorbild sein w

Material und Methoden 21 Spannungsgerät Heinzinger, Rosenheim, Deutschland Spektralphotometer Novaspec III GE Healthcare, München, Deutschland T

Material und Methoden 22 3.1.4 Kits und Reaktionsmixe Tab. 3.4: Kommerzielle Kits und Reaktionsmischungen Kit-Bezeichnung Bezugsquelle Anwendung

Material und Methoden 23 3.2 Stämme Tab. 3.5: Verwendete Stämme Stamm Relevante Genotypische Marker Referenz B. subtilis 168 trp+ Zeigler et

Material und Methoden 24 B. subtilis GP335 trpC2 lys-3 ccpA::Tn917 erm, ptsHI Ludwig et al., 2002 B. subtilis WH1079 Derivat von GP335, amyE::(a

Material und Methoden 25 3.3 Plasmide Tab. 3.6: Verwendete Plasmide Plasmid Genotypische Charakterisierung Referenz pAC6 Integrationsplasmid in

Material und Methoden 26 3.4 Oligonukleotide Die Oligonukleotide, die in dieser Arbeit verwendet wurden (Tab. 3.7), wurden von MWG Bio

Material und Methoden 27 NSt_xylAivT PCR Dot Blot Standard xylA ATAGGTGATGTACTTACTAT NST_xylArevBam Klonierung pWH2349 CCAGGATCCGTGTGGAAATTAGCTC

Material und Methoden 28 3.5 Medien 3.5.1 Vollmedien Alle Vollmedien wurden hergestellt, indem alle Komponenten in deionisiertem Wasser gelöst

Material und Methoden 29 CSK + BCAA 1 x C-Salze 0,6 % (w/v) Na-Succinat 0,8 % (w/v) Kaliumglutamat 50 µg/ml L-Tryptophan 1 x CAF 1

Material und Methoden 30 Sterilfilters mit einer Porengröße von 0,2 µm sterilisiert. Sofern nicht anders vermerkt, wurden alle Lösungen bei Raum

Danksagung Prof. Dr. Wolfgang Hillen möchte ich für die Möglichkeit der Promotion an diesem Lehrstuhl danken. Er stand stets für fachliche Unt

Material und Methoden 31 Spurensalze, 100 x (S)* 60 mg/l Na2MoO4*2H2O 43 mg/l CuCl2*2H2O 60 mg/l CoCl2*6H2O 100 mg/l MnCl2*4H2O 170

Material und Methoden 32 3.6 Puffer und Lösungen Alle in dieser Arbeit verwendeten Puffer und Lösungen wurden, soweit nicht anders vermerkt, mi

Material und Methoden 33 Größenmarker für DNA-Fragmente DNA-Leiter-Mix, PEQLAB, Erlangen, Angaben in bp 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 30

Material und Methoden 34 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Sambrook & Russell, 2001 Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli mittels Nucleospin

Material und Methoden 35 34 µl 1 M MgSO4 versetzt. Anschließend wurde diese Suspension analog zu frischen Zellen weiterverwendet. Für die Trans

Material und Methoden 36 3.7.5 Anlegen von Bacillus-Dauerkulturen Für die Erstellung einer Dauerkultur wurden 4 ml LB-Medium mit entspr

Material und Methoden 37 3.7.6.2 Lebendtiterbestimmung Für jede Probe erfolgte die Bestimmung des Lebendtiters, indem zwei aufeinander

Material und Methoden 38 angesehen werden kann. Reine Chemikalien wie z.B. Ethanol wurden aus separaten Originalabfüllungen entnommen.

Material und Methoden 39 3.7.9 Quantitative RT-PCR (RT-qPCR) 3.7.9.1 Allgemeine Vorgehensweise Alle RT-qPCR-Analysen wurden mit dem 

Material und Methoden 40 3.7.9.2 Analyse des externen Standards Dieser Ansatz ermöglichte die Quantifizierung von DNA in einer qPCR und setzte

Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis 1 ZUSAMMENFASSUNG 1 2 EINLEITUNG 2 2.1 Der Modellorganismus Bacillus subtilis 2 2.2 Das Phosphoe

Material und Methoden 41 Verwendung von Gleichung (3.2) wurde der prozentuale Anteil der genomischen DNA im Vergleich zur Gesamt-RNA erm

Material und Methoden 42 Unter Verwendung von Gleichung (3.3) wurde die Transkriptmenge je KbE ermittelt:   

Material und Methoden 43 3.7.11 RNA-Hybridisierung (Dot Blot) Die Analyse der Genexpression auf mRNA-Level erfolgte durch quantitative RNA-Hybr

Material und Methoden 44 Natriumacetat zugefügt. Anschließend erfolgte die Fällung der RNA durch Zugabe von 1,5 ml eines eiskalten

Material und Methoden 45 3.7.11.3 Durchführung des Dot Blots Für die Analyse der Genexpression mittels RNA-Hybridisierungs-experimenten w

Material und Methoden 46 Blockierlösung, 1 x 1 Teil 10 x Blockierlösung 9 Teile 1 x Maleinsäurepuffer Aliquots à 10 ml wurden bei -20°C

Material und Methoden 47 wurden bei 37°C und 200 bis 300 rpm geschüttelt. Zu den entsprechenden Zeitpunkten wurde die OD600 der Kultur bestimmt

Material und Methoden 48 Z-Puffer, 5 x 300 mM Na2HPO4*12H2O 200 mM NaH2PO4*H2O 50 mM KCl 5 mM MgCl2*7H2O 250 mM -Mercaptoethanol 1 x Z

Ergebnisse 49 4 Ergebnisse 4.1 Optimierung des Minimalmediums M9 Das Durchführen von Analysen in unabhängigen Laboren und anschließende

Ergebnisse 50 0,010,11100 60 120 180 240 300 360 420 480 540OD600t [min] Abb. 4.1: Wuchskurve von B. subtilis 168 in M9SysMO ohne ()

Inhaltsverzeichnis II 3.2 Stämme 23 3.3 Plasmide 25 3.4 Oligonukleotide 26 3.5 Medien 28 3.5.1 Vollmedien 28 3.5.2 Minimalmedien 28

Ergebnisse 51 Abb. 4.2: Wuchsverhalten von B. subtilis 168 in Abhängigkeit der optischen Dichte der Vorkultur. Wenn die Vorkultur zum Zei

Ergebnisse 52 Abb. 4.3: Wuchsverhalten von B. subtilis 168 (WT, ) und B. subtilis WH1117 (xylR::erm, ). Die Insertion der Er

Ergebnisse 53 Fluoreszenz während der Amplifikation ermöglicht die Bestimmung des PCR-Zyklus, bei dem die Fluoreszenzkurve den Schwellenwert

Ergebnisse 54 Letzterer erreicht jedoch eine dreifach höhere Ausbeute an Gesamt-RNA. Daher wurde bei allen nachfolgenden RNA-Präparation

Ergebnisse 55 Tab. 4.1: Gesamtmenge RNA aus 5 OD-Äquivalenten B. subtilis in Abhängigkeit der Elutionsmethodik bei der Präparation der Gesamt-RN

Ergebnisse 56 Oligonukleotide getestet, wobei die bereits verwendeten qPCR-Primer und die Annealingtemperatur von 59°C beibehalten wurden

Ergebnisse 57 Schmelzkurven- und Agarosegelanalyse untersucht. Basierend auf diesen Analysen wurde für alle weiteren RT-qPCR-Experime

Ergebnisse 58 Tab. 4.2: PCR-Effizienzen [%] bei Verwendung des qPCR-Primerpaars rtPCR_xynP1 cDNA-Primer cDNA_xynP1 cDNA_xynP2 cDNA_xynP3

Ergebnisse 59 4.4.4 Klonierung der Plasmide pWH2348 (xynP) und pWH2349 (xylA) Die Quantifizierung absoluter mRNA-Mengen in einer RT-

Ergebnisse 60 bis 10 Kopien pro Ansatz. Der Reaktionsmix entspricht der unter Punkt 3.7.9.2 beschriebenen Zusammensetzung. Die aus

Inhaltsverzeichnis III 3.7.11.1 Herstellung eines externen RNA-Standards 43 3.7.11.2 Herstellung der genspezifischen RNA-Sonden 44 3.7.11.3 Du

Ergebnisse 61 4.4.6 Etablierung der externen Standardkurve der RT-qPCR für xynP Die Validierung der externen Standardkurve für die Quantifi

Ergebnisse 62 4.4.7 Test auf Inhibierung der qPCR durch Reverse Transkriptase     --Systemen, bei

Ergebnisse 63 4.5 Konstruktion von B. subtilis WH1117 und B. subtilis WH1118 Der Einfluss der CcpA-vermittelten Regulation in B. s

Ergebnisse 64 Abb. 4.8: Klonierung der xylR-Deletionsstämme B. subtilis WH1117 und WH1118. Ausgehend -) erfolgte die K

Ergebnisse 65 4.6 Quantifizierung der intrazellulären mRNA-Menge mittels RT-qPCR 4.6.1 Quantifizierung der xylA-mRNA in B. subtilis WH1

Ergebnisse 66 Abb. 4.9: Quantifizierung des intrazellulären xylA-Transkripts () in B. subtilis WH1118 (∆xylRCm) in Abhängigkeit des Z

Ergebnisse 67 Transkriptmenge pro KbE. Die detektierten Transkriptkonzentrationen lagen für das durchschnittliche Zellvolumen von B. subtilis vo

Ergebnisse 68 4.7 β-Galaktosidase-Aktivitätsmessungen von xylA und xynP 4.7.1 β-Galaktosidase-Aktivität von xylA::lacZ Um die Expression e

Ergebnisse 69 Abb. 4.11: -Galaktosidase-Aktivität einer xylA::lacZ-Fusion in B. subtilis WH1122 (∆xylR) in Abhängigkeit des Zellwachstums. Die

Ergebnisse 70 Abb. 4.12: -Galaktosidase-Aktivitätsmessung einer xynP::lacZ-Fusion in B. subtilis WH1084 (WT, Zugabe von 0,2 % (w/v) Xylose,

Inhaltsverzeichnis IV 4.7.1 -Galaktosidase-Aktivität von xylA::lacZ 68 4.7.2 -Galaktosidase-Aktivität von xynP::lacZ 69 4.8 RNA-Hybridisi

Ergebnisse 71 4.8 RNA-Hybridisierung zur Detektion des xynP-Transkripts Die Validierung der absoluten Quantifizierung der Transkriptkonzentr

Ergebnisse 72 Abb. 4.13: Schematische Darstellung der Konstruktion genspezifischer RNA-Sonden. Mittels der Oligonukleotide der qPCR

Ergebnisse 73 Überquantifizierung der mRNA führen würde. Daher wurden die nachfolgenden RNA-Hybridisierungen ausschließlich qualitativ an

Ergebnisse 74 Abb. 4.15: Dot Blot für die Detektion von xynP in Abhängigkeit des Zellwachstums. Die Werte über bzw. unter den Punkten en

Ergebnisse 75 Abb. 4.16: Bestimmung der Halbwertszeit der xylA-mRNA in B. subtilis WH1117 (A) und der xynP-mRNA in WH1118 (B). Die quantifizier

Ergebnisse 76 Damit ergab sich folgendes Ratenverhältnis: =0,43Transkripteh und KbE20Transkripteh und KbE19,56Transkripteh und KbE-=1,33Transk

Ergebnisse 77 4.11 Abhängigkeit der alsS-Expression in B. subtilis von der Kohlenstoffquelle 4.11.1 Konstruktion von B. subtilis WH1078

Ergebnisse 78 wurden alle nachfolgenden Untersuchungen in dieser Wuchsphase durchgeführt. Abb. 4.17: W -Galaktos

Ergebnisse 79 (PEP-PTS) oder über ein PTS-unabhängiges Transportsystem in die Zelle aufgenommen werden. In allen Messungen wurde S

Ergebnisse 80 quellen erreichten ein Niveau von 7 % bis 40 % bezogen auf Glukose (Abb. 4.18). Im ccpA-Deletionsstamm WH1078 wurde unabhängi

Inhaltsverzeichnis V 5.5 Ausblick 91 6 LITERATURVERZEICHNIS 92 7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 110

Diskussion 81 5 Diskussion 5.1 Etablierung der absoluten Quantifizierung intrazellulärer Transkriptmengen in B. subtilis Die Reaktion

Diskussion 82 Analyse von Umweltproben (Bach et al., 2002; Galluzzi et al., 2004; Johnson et al., 2005; Perini et al., 2011; Smith & Osborn,

Diskussion 83 5.2 Zeitaufgelöste quantitative Analyse der Transkription von xylA und xynP Im Rahmen dieser Arbeit wurden die intrazelluläre

Diskussion 84 Vergleich zum Wildtypstamm. Daraus resultiert eine schwächere Glukoserepression von Faktor vier im xylR-Deletionsstamm

Diskussion 85 (Singh et al., 2008) (Abb. 4.12). Die Expression von xynP wird in einem xylR-Deletionsstamm durch CcpA allein stärker reprimi

Diskussion 86 Aus den beiden bestimmten Parametern kann nun die Transkriptionsrate berechnet werden (siehe 4.10). Pro Stunde und KbE werden im V

Diskussion 87 5.4 Regulation der alsS-Expression in KKR-defizienten B. subtilis-Stämmen Die alsS-Expression wird indirekt positiv von

Diskussion 88 der ∆ccpA- bzw. der ptsHI-Mutante etwa um den Faktor 20 erhöht, konnte das Niveau des Wildtyps jedoch nicht erreichen (Abb. 4.

Diskussion 89 Bereich des alsS-Gens eine stark degenerierte cre-Sequenz postuliert, deren Funktionalität bisher nicht bestätigt wurde. Möglichk

Diskussion 90 2002), eine stark degenerierte cre-Sequenz beschrieben, welche die Expression aufgrund der Position zum Transkriptions